海棠(Malus spp.)属蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)植物，在中国有着悠久的栽培历史，具有很高的观赏价值，在近代园林绿化中应用广泛(俞德浚和阎振茏, 1956, 植物分类学报, 5(2): 77-110; 李育农, 2001,中国农业出版社, pp.201-266)。近200多年，在从中国引种并进行大量杂交选育的基础上，国外园艺工作者培育了一系列观花、观果和观叶海棠新品种，统称为观赏海棠(Dirr, 1990)。适当引进欧美观赏海棠品种进行驯化，选育适宜我国不同立地条件生长的优良品种，可快速提高和丰富我国城乡园林景观层次，亦为培育具有自主产权的新品种提供了大量亲本。但苹果属植物遗传背景复杂，尤其海棠遗传多样性极为丰富，使得(观赏)海棠品种鉴定和分类困难(陈恒新等, 2007; 郑杨等, 2008)，给推广应用、新品种选育带来了的不便。因此，运用合适的技术手段，准确分析观赏海棠的遗传多样性成为必要。

目前，观赏海棠的研究主要涉及物种起源(成明昊等, 2002; 石胜友等, 2006)、遗传多样性和品种分类(Ranney and Eaker, 2004; 郭翎等, 2009; 沈红香等, 2011)、逆境生理(Lloyd et al., 2006; 胡玉净等, 2012)及性状分析(刘志强和汤庚国, 2004; 文樵夫等, 2010)等方面，其中关于海棠遗传多样性的研究出现较早，内容也较为丰富。中国古代书籍《花谱》和《群芳谱》等记载了很多传统观赏海棠，并描述了其性状多样性和品种差异。在近代，国内外学者运用形态学分类（刘志强和汤庚国, 2004; 郑杨等, 2008）、形态解剖学和孢粉学分类(Martens and Fretz, 1980a; 1980b; 李晓磊等, 2008)、同工酶标记分类(Marquard and Chan, 1995; Simo Santalla et al., 2000)等方法，对观赏海棠进行了遗传多样性分析和品种分类，并取得了一定的成果。但由于研究层次和使用标准的不同，上述方法所获得数据仍存在很多差异或争议(陈恒新等, 2007; 楚爱香和汤庚国, 2008, 生物学通报, 43(7): 15-17)。

分子标记技术可在DNA水平检测生物间差异，不受环境与基因表达差异的影响，与传统形态学鉴定和同工酶鉴定技术相比，可更接近真实地反映物种间遗传分化关系。目前，分子标记技术已发展出RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SRAP及SNP等多种方法。其中，AFLP分子标记(Vos et al., 1995)具有多态性好、稳定性高、均匀分布全基因组等特点，在几种分子标记中所反映的生物信息最多，综合效用最大，现已广泛应用于种质资源鉴定和分类(张强英等, 2012)、物种遗传多样性分析(Hend et al., 2009)等领域。目前，涉及分子标记技术分析观赏海棠遗传多样性已有报道，但其样本多限于某些(品)种(石胜友等, 2006; Benson et al., 2001; 楚爱香和汤庚国, 2008)、后代群体(赵天田等, 2010; 沈红香等, 2011)，或偏重于物种演化和起源关系(张宁等, 2007)。针对大样本量欧美观赏海棠品种遗传多样性的分析及品种分类还未有研究。

本试验以经8年筛选的适合我国北方区生长的31种欧美观赏海棠为对象，利用AFLP分子标记技术对其进行遗传多样性和亲缘关系分析，旨在为所引进欧美观赏海棠品种鉴定和分类，以及自主新品种培育的亲本选择等提供分子生物学依据。

1结果与分析
1.1 31个样品DNA的提取
DNA提取完成后，通过测定紫外光吸收值，确定了其浓度和纯度，并用0.8% Agarose胶电泳，发现DNA完整性较好。

1.2预扩增产物电泳检测
对31个样品预扩增进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，可见产物条带呈弥散状，DNA片段多集中于250~750 bp，说明酶切较完全, 接头连接较好。

1.3 AFLP扩增产物多态性
从94对引物组合中筛选出带型清晰稳定、多态性高的引物10对：E41M51C、E42M51G、E41M51G、E44M51C、E44M51G、E83M51C、E83M51G、E84M51C、E85M51G、E86M51C(表1)，对31份海棠种质材料进行选择性扩增，获得了较好的扩增效果。共扩增出601条DNA条带，多态性条带519条，多态性位点平均为86.22%，不同种质之间存在一定的遗传差异。在10对引物中，以E44M51G组合扩增的位点最多，为71个；E83M51G组合最少，为52个；引物组合E83M51C扩增的多态性位点比率最高，为95.08%(图1)；E41M51C扩增的多态性位点比率最低，为76.36%。这表明不同引物对扩增出的多态带数量及比率存在一定的差异。

表1 31个样本AFLP扩增产物的多态性及遗传多样性 Table 1 The polymorphism of AFLP amplified bands and genetic diversity among the 31 samples

图1引物E83/M51C组合对31个样品AFLP选择性扩增图谱 Figure 1 Map of AFLP selection amplification in primers E83/M51C for 31 samples

1.4 31种欧美观赏海棠种质的遗传多样性
Nei′s基因多样性指数(H)、Shannon信息指数(I)是度量遗传多样性水平的常用指标。31份海棠种质的Nei’s基因多样性指数为0.184 4~0.313 0，平均0.240 6；Shannon信息指数为0.300 5~0.470 8，平均0.376 5 (表1)，说明供试海棠种质表现出较高的遗传多样性。对于所选用的10对引物而言，所揭示的各海棠种质相应位点的遗传多样性存在一定差异：E86M51C引物组合显示的Nei′s基因多样性和Shannon信息指数最低，E84M51C组合最高(表1)，表明合适的引物组合筛选对全面揭示供试31种海棠种质资源遗传多样性十分重要。

1.5 31种欧美观赏海棠种质的聚类分析
对31份海棠种质进行UPGMA聚类分析并绘制树状图(图2)。以遗传距离0.204为界，可将供试样品分为以下5类。第一类有17份种质，包括‘爱丽’海棠、‘盛花’海棠、‘美丽’海棠和‘印第安魔力’
海棠等。其中‘爱丽’海棠、‘盛花’海棠和‘莱姆’海棠遗传距离最小，表明三者亲缘关系最近。第二类有11份种质，包括‘春雪’海棠、‘道格’海棠、‘琥珀’海棠、森林苹果海棠和‘绚丽’海棠等。其中‘琥珀’海棠、‘鲁道夫’海棠、‘奈微利考伯曼’海棠和‘霹雳贝贝’海棠亲缘关系较近。第三、四和五类均只有1份样品，分别为‘粉芽’海棠、钟诺斯海棠和‘王族’海棠，各自单成一类，三者之间以及与第一、二类群中品种(种)遗传距离大，亲缘关系远。

图2 31种欧美观赏海棠的聚类分析 Figure 2 Cluster analysis of 31 Euramerican ornamental crabapples

2讨论
本研究利用AFLP分子标记技术，首次对31个欧美观赏海棠品种进行了遗传多样性和亲缘关系分析。在第一类群中，‘爱丽’海棠、‘盛花’海棠和‘莱姆’海棠的亲缘关系最近，与多花海棠、‘里赛特’海棠及‘希尔’海棠聚为一亚类，是31份种质资源中亲缘关系最近的一组。此六种海棠均为红色花瓣，暗示10对引物扩增的多态性条带可能与海棠花色性状相关。而在形态学分类中，前五种海棠均被归入花红色、单瓣一类，‘希尔’海棠被归入花红色、重瓣一类。因此，对‘希尔’海棠而言，在分子水平上与红花单瓣品种亲缘关系较近，但形态上属于红花重瓣品种，由此表明，‘希尔’海棠是由红花单瓣品种雄蕊瓣化而来，这为观赏海棠重瓣花由单瓣花进化而来的观点提供了分子生物学论据。

第二类群中，‘春雪’海棠、‘道格’海棠、‘琥珀’海棠、‘鲁道夫’海棠、‘奈微利考伯曼’海棠、‘霹雳贝贝’海棠和‘约翰东’海棠聚为一个亚类，亲缘关系较近，其中花朵白色、具香味的‘春雪’海棠与‘道格’海棠独成一枝，与其他五种花色偏红(‘约翰东’除外)、无香味海棠分开。此结果验证了‘道格’是‘春雪’亲本的关系(郭翎等, 2009)，也暗示了所扩增多态性条带可能与花色花香相关；并提示育种者，‘琥珀’海棠、‘鲁道夫’海棠、‘奈微利考伯曼’海棠、‘霹雳贝贝’海棠和‘约翰东’海棠是培育具花香新观赏海棠品种的合适亲本材料。
目前，涉及欧美观赏海棠分子标记分类的研究不多。在郭翎等(2009)对72个苹果属种、杂交种及品种的AFLP分析中，‘印第安魔力’海棠与‘斯普伦格教授’海棠亲缘关系较近，与多花海棠、‘印第安魔力’海棠聚在一个类群内。在本研究中，上述4个海棠亦聚在同一类群，但与‘斯普伦格教授’海棠亲缘关系较近的为平枝海棠，推测这主要是由两者供试材料差异较大及AFLP选择性扩增引物不同造成的。‘春雪’海棠、‘道格’海棠和‘绚丽’海棠聚类在第二类群，亲缘关系较近，符合三者亲本之一均为山荆子(M. baccata)的事实(郑杨等, 2008; 郭翎等, 2009)。
AFLP聚类结果所体现的是种质间基因型的差异，而形态性状表现的是某些功能基因在内部和外部环境的共同作用下表达的结果(沈红香等, 2011)。因此，在对引种的欧美观赏海棠品种分类中，AFLP分子标记分类与传统形态学分类两者之间仍存在一定的差异。在生产实践中，两种方法(及其他研究方法)需要结合使用，才能使观赏海棠品种分类达到较合理水平(陈恒新等, 2007)。

3材料与方法
3.1试验材料
2004年2月起，课题组从荷兰、美国引进观赏海棠品种(种)46个，在济南历城西营镇定植。经过多年的生长适应性调查比对，于2012年6月初步筛选出观赏价值高、抗性较好的种质31份进行AFLP试验(表2)。

表2 供试的欧美观赏海棠31个品种(种) Table 2 Introduction of 31 Euramerican ornamental crabapples

3.2试验方法
3.2.1DNA提取
随机选取一定量幼嫩叶片，苯酚-氯仿法提取DNA。通过测定紫外光吸收值来确定DNA浓度和纯度，并用 0.8% Agarose胶检测电泳检查DNA完整性。

3.2.2 AFLP试验
(1)酶切对所选样品采用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切：酶切体系(20 μL)为：10×T4 Buffer 4 μL；EcoRⅠ (10 U/μL) 0.4 μL；MseⅠ(10 U/μL) 0.4 μL；模板DNA 约200 ng；补ddH₂O至20 μL。酶切反应条件为37℃ 3 h，65℃，3 h。
(2)连接连接体系(20 μL)为：10×T4 Buffer 2 μL；EcoRⅠAdaptor (50 μmol/L) 1 μL；MseⅠAdaptor (50 μmol/L )1 μL；T4 ligase 0.4 μL (5 weiss U/μL)酶切产物约10 μL；补ddH₂O至20 μL。

(3)预扩增反应体系：2×PCR Mix 10 μL；E₀₀ 0.5 μL (20 μmol/L)；M₀₀ 0.5 μL (20 μmol/L)；连接模板2 μL；加ddH₂O至20 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性45 s；50℃复性45 s，72℃延伸1 min，26个循环。

(4)选择性扩增反应体系：2× PCR Mix 10 μL；E_primer 1 μL (20 μmol/L)；M_primer1 μL (20 μmol/L)；模板DNA 5 μL (预扩产物稀释20倍)；加ddH₂O至20 μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性35 s，65℃复性35 s，72℃延伸1 min，12个循环；94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸1 min， 23个循环。

(5)电泳和染色电泳时，先在90 W恒功率条件下预电泳30 min，然后按样本编号从小到大的顺序进行点样(7.5 μL)，90W恒功率电泳1.5 h。染色方式采用银染。

所用EcoRⅠ酶以及所用接头、引物购自上海英骏生物工程技术服务有限公司, MseⅠ酶、T4 DNA Ligase酶购自Promega公司。接头和引物序列详见表3。

表3 AFLP引物和接头序列 Table 3 Primers and adapters sequence for AFLP

3.2.3数据分析
选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，以“1”和“0”分别记录条带的有无。在相同片段位置上有带记为“1”，无带记为“0”。制作0 /1矩阵，作0 /1矩阵输入POPGENE1. 32软件进行分析。计算个体间Nei相似系数(Nei and Li, 1979)，并用NTSYSpc2. 10进行UPGMA聚类分析。

作者贡献
房义福、宋国防是本研究的实验设计和实验研究的执行人；刘凤栾、吴晓星及姜莉华完成数据分析，论文初稿的写作；姜楠南、王翠香参与实验设计，试验结果分析；房义福是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由山东省农业良种工程(鲁科农社字2007-217)资助。作者感谢山东农业大学林学院孙居文教授对本研究的技术支持与指导。

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